Охарактеризування очищеного рекомбінантного протеїну CRM197 як інструмента дослідження дифтерійного токсину

Abstract

Очищення експресованого в клітинах Escherichia coli нетоксичного дифтерійного токсоїду CRM197, проведене за допомогою металоафінної хроматографії після руйнування бактеріальної ДНК та клітинної стінки ензимами, дало можливість позбутися домішок ендогенних пороформуючих протеїнів. Показано, що мічений флуоресцеїн ізотіоціанатом препарат CRM197 виявляв здатність до зв’язування та інтерналізації клітинами ссавців ліній Vero та L929. Прикладання позитивного потенціалу з боку додавання СRM197 (2–20 нM) до фосфатидилетаноламінвмісної бішарової мембрани (БЛМ) у розчині 1 M KCl (pH 4,8) призводило до утворення потенціалозалежних іонних каналів з провідністю 20 пСм, як показано у класичних дослідженнях дифтерійного токсину природного походження. Енергія активації, визначена для стаціонарного струму через багатоканальну БЛМ у розчині 1 М КС l (pH 6,0) та самого розчину без БЛМ, становила 2,967 ± 0,167 і 2,933±0,115 ккал/моль відповідно, що свідчить про утворення протеїном CRM197 трансмембранної водної пори.Очистка экспрессированного в клетках Escherichia coli нетоксичного дифтерийного токсоида CRM197, проведенная с помощью металлоаффинной хроматографии после разрушения бактериальной ДНК и клеточной стенки энзимами, позволила удалить примеси эндогенных пороформирующих белков. Показано, что меченый флуоресцеин изотиоцианатом препарат CRM197 проявлял способность к связыванию и интернализации клетками млекопитающих линий Vero и L929. Приложение положительного потенциала со стороны добавления СRM197 (2–20 нM) к фосфатидилэтаноламинсодержащей бислойной мембране (БЛМ) в растворе 1 M KCl (pH 4,8) приводило к образованию потенциалозависимых ионных каналов с проводимостью 20 пСм, как показано в классических исследованиях дифтерийного токсина природного происхождения. Энергия активации, определенная для стационарного тока через многоканальную БЛМ в растворе 1 М КС l (pH 6,0) и сам раствор без БЛМ, составила 2,967 ± 0,167 и 2,933±0,115 ккал/моль соответственно, что свидетельствует об образовании протеином CRM197 трансмембранной водной поры.The purification of non-toxic diphtheria toxoid CRM197 expressed in Esherichia coli by metalaffinity chromatography following the enzymatic digestion of a bacterial cell wall and DNA allowed us to avoid the contamination by endogenous pore-forming proteins. It was shown that the fluorescein isothiocyanate-labeled samples of CRM197 are capable of binding and internalizing by mammalian cells Vero and L929. The introduction of СRM197 (2–20 nM) at positive voltages from the side of phosphatidylethanolamine-containing bilayer membrane (BLM ), were the toxoid was added, resulted in the creation of potential-dependent ionic channels with the conductance of 20 pS in the bathing solution of 1M KCl buffered at pH 4.8, as had been shown in classic studies of wild-type diphtheria toxin. The activation energies measured for the CRM197-created steady-state macroscopic current on one side of BLM in the solution of 1 M KCl (pH 6.0) and the solution without membrane are equal to 2.967 ± 0.167 кcаl/mol and 2.933±0.115 кcal/mol, respectively, which suggests the formation of a transmembrane water pore by CRM197.