Бактеріальна експресія та мічення ізотопами ¹³C/¹⁵N цитокіну EMAP II для структурних досліджень методом ЯМР-спектроскопії

Abstract

Мета. Отримання рекомбінантного цитокіна EMAP II в препаративних кількостях з використанням бактеріальної експресії та його ізотопне мічення для дослідження просторової структури методами мультивимірної ЯМР-спектроскопії. Методи. EMAP II експресовано в клітинах Еscherichia соli BL21 (DE3)pLysE на мінімальному середовищі з міченням ізотопами ¹³C/¹⁵N та очищено методом метал-хелатуючої хроматографії на Ni-NTA-агарозі. Для перевірки маси і чистоти мічених рекомбінантних білків застосовано метод мас-спектрометрії. Одержано двомірні ЯМР-спектри рекомбінантного цитокіну EMAP II у розчині. Результати. Отримано препарати рекомбінантного білка EMAP II, мічені ізотопами ¹³C/¹⁵N, які проаналізовано методом ЯМР-спектроскопії. Висновки. Дисперсія сигналів ЯМР у двомірних спектрах ¹H/¹⁵N і ¹³C/¹⁵N-HSQC підтверджує наявність компактної тривимірної структури білка. Ізотопно мічені препарати EMAP II зберігають стабільність протягом 5–6 днів, що дає можливість подальшого визначення просторової структури білка в розчині методом ЯМР-спектроскопії. Ключові слова: цитокін, EMAP II, ізотопне мічення, мас-спектрометрія, ЯМР-сектроскопія, двомірні спектри.Цель. Получение рекомбинантного цитокина EMAP II в препаративных количествах с использованием бактериальной экспрессии и его изотопное мечение для исследования пространственной структуры методами мультимерной ЯМР-спектроскопии. Методы. EMAP II экспрессирован в клетках Еscherichia соli BL21 (DE3)pLysE на минимальной среде с мечением изотопами ¹³C/¹⁵N, а также очищен методом металл-хелатирующей хроматографии на Ni-NTA-агарозе. Для проверки массы и чистоты меченых рекомбинантных белков применен метод масс-спектрометрии. Получены двухмерные ЯМР-спектры рекомбинантного цитокина EMAP II в растворе. Результаты. Выделены препараты рекомбинантного белка EMAP II, меченные изотопами ¹³C/¹⁵N, которые исследовали методом двухмерной ЯМР-спектроскопии. Выводы. Дисперсия сигналов ЯМР в спектрах ¹H/¹⁵N и ¹³C/¹⁵NHSQC подтверждает наличие компактной трехмерной структуры белка. Изотопно меченные препараты EMAP II сохраняют стабильность на протяжении 5–6 дней, что дает возможность дальнейшего определения пространственной структуры белка в растворе методом ЯМР-спектроскопии. Ключевые слова: цитокин, EMAP II, изотопное мечение, массспектрометрия, ЯМР-спектроскопия, двухмерные спектры.Aim. Bacterial expression and isotopic labeling of recombinant EMAP II in preparative scale with the aim to study its spatial structure by NMR spectroscopy. Methods. The recombinant ¹⁵N, ¹³C/¹⁵-double labeled EMAP II protein was expressed in Еscherichia соli BL21(DE3) pLysE on M9 minimal medium and purified by metal-chelated chromatography on Ni-NTA agarose. Quality of obtained for NMR studies ¹H/¹⁵N і ¹³C/¹⁵-double labeled EMAP II was confirmed by mass spectroscopy and used for preparation of NMR samples. Results. The preparations of ¹⁵N and ¹³C/¹⁵N double labelled EMAP II were obtained. The recorded NMR spectra of EMAP II were analyzed. Conclusions. Dispersion of NMR signals in two-dimensional ¹H/¹⁵N і ¹³C/¹⁵NHSQC spectra confirm the presence of compact three-dimensional structure of the protein. The NMR samples were stable at least for 5–6 days at chosen conditions. These results will be used as a starting point for determination of high resolution three-dimensional structure of recombinant EMAP II cytokine in solution by NMR spectroscopy. Keywords: cytokine, EMAP II, isotopic labeling, mass spectroscopy, NMR spectroscopy, two-dimensional spectra.