Виділення і очищення ізоакцепторних форм тPHK₁Ser і тPHK₂Ser із Thermus thermophilus

Abstract

Серинова аміноацилювальна система є унікальною в тому розумінні, що це єдина система, де синтетаза 2-го структурного класу впізнає тРНК з довгою варіабельною гілкою (тРНК 2-го типу), що становить особливий інтерес для вивчення механізмів упізнавання тРНК відповідною аміноацил-тРНК синтетазою. Викладено методичні підходи до отримання високоочищених ізоакцепторних тPHK₁Ser і тPHK₂Ser з екстремального термофіла Т. thermophilus у міліграмових кількостях, необхідних для структурних досліджень. Розроблений метод очищення тPHKSer включає хроматографію на бензоїльованій ДЕАЕ-целюлозі і високоефективну рідинну хроматог­рафію на аніонообмінній колонці Spherogel TSK DEAE 5PW та оберненофазовій колоці Ultrapore С8 з використанням обладнання HPLC.Serine aminoacylation system is unique as it is the only system where synthetase of class II recognizes tRNA with a long variable stem (type II tRNA) which is of great interest to study the mechanisms of tRNA recognition by corresponding aminoacyl-tRNA synthetase. Current paper presents the methodological approaches for obtaining purified isoacceptor тPHK₁Ser and тPHK₂Ser in milli­gram quantities from extremal thermophil T. thermophilus for crystallography. The developed method of tRNA purification employs the chromatography on benzoylated diethylaminoethylcellulose and high-performance liquid chromatography on anionexchange column Spherogel TSK DEAE 5PW, and reverse phase column Ultrapore C8 using HPLC equipment (Beckman).Сериновая аминоацилирующая система является уникальной в том понимании, что это единственная система, в которой синтетаза 2-го структурного класса узнает тРНК с длинной вариабельной ветвью (тРНК 2-го типа), что вызывает осо­бый интерес при изучении механизмов узнавания тРНК соот­ветствующей аминоацил-тРНК синтетазой. Изложены мето­дические подходы к получению методам хроматографии высокоочищенных изоакцепторных тPHK₁Ser и тPHK₂Ser из экс­тремального термофила Т. thermophilus в миллиграммовых количествах, необходимых для структурных исследований. Разработанный метод очистки тРНК включает хроматог­рафию на бензоилированной ДЭАЭ - целлюлозе, высокоэффек­тивную жидкостную хроматографию на анионобменной ко­лонке Spherogel TSK DEAE 5PW и обратнофазовой колонке Ultrapore С8 с использованием оборудования HPLC.