Синтез на однонитевой кольцевой ДНК фага М13, направляемый ДНК-полимеразой вируса ядерного полиэдроза тутового шелкопряда

Abstract

Из куколок тутового шелкопряда Bombух mori, инфицированных вирусом ядерного полиэдроза (ВЯП), выделена вирусспецифичная ДНК-полимераза (ВЯП-полимераза), ВЯП-полимераза представляет собой полипептид с молекулярной массой 136 000 и коэффициентом седиментации 6,3 S. Фермент предпочитает в качестве матрицы poly(dA) с затравкой (dT)₁₀ и не активен при использовании poly (А). Частично очищенная ВЯП-полимераза активна на однонитевой кольцевой ДНК фага М13 в отсутствие затравки. Способность к синтезу на ДНК М13 обусловлена присутствием в препаратах ВЯП-полимеразы Mg²⁺-зависимой эндонуклеазы, специфичной в отношении двунитевых участков ДНК. Эндонуклеаза присутствует в препаратах ВЯП-полимеразы после фракционирования экстракта инфицированных куколок сульфатом аммония, хроматографии на фосфоцеллюлозе и оксиапатите, но может быть отделена от ВЯП-полимеразы при ультрацентрифугировании в градиенте глицерина в присутствии 200 мМ фосфата калия. При снижении концентрации соли ВЯП-полимераза и эндонуклеаза проявляют тенденцию к агрегации.

З лялечок шовковичного шовкопряда Bombух mori, інфікованих вірусом ядерного поліедрозу (ВЯП), виділено вірусоспеціфічну ДНК-полімеразу (ВЯП-полімеразу), ВЯП-полімераза представляє собою поліпептид з молекулярною масою 136 000 і коефіцієнтом седиментації 6,3 S. Фермент надає перевагу як матриці poly (dA) із затравкою (dT)₁₀ і не активний при використанні poly (А). Частково очищена ВЯП-полімераза активна на однонитчастій кільцевій ДНК фага М13 за відсутності затравки. Здатність до синтезу на ДНК М13 обумовлена присутністю в препаратах ВЯП-полімерази Mg²⁺-залежної ендонуклеази, специфічної щодо двунитчастих ділянок ДНК. Ендонуклеаза присутня в препаратах ВЯП-полімерази після фракціонування екстракту інфікованих лялечок сульфатом амонію, хроматографії на фосфоцелюлозі і оксиапатиті, але може бути відокремлена від ВЯП-полімерази при ультрацентрифугуванні в градієнті концентрації гліцерину за присутності 200 мМ фосфату калію. При зниженні концентрації солі ВЯП-полімераза і ендонуклеаза виявляють тенденцію до агрегації.

A virus-induced DNA polymerase (B. m. NPV polymerase) was purified from the silkworm Bombyx mori pupae infected with nuclear polyhedrosis virus (B. m. NPV). NPV polymerase is a polypeptide with a molecular weight of 136 kDa and a sedimentation coefficient of 6.3 S. As a template, B. m. NPV polymerase prefers polydeoxynucleotide poly(dA) with a primer (dT)₁₀ and is inactive when using poly(A). Partially purified B. m. NPV polymerase is active on the single-standed circular phage M13 DNA in the absence of a primer. The ability to utilize phage M13 DNA as a template is due to the presence of a Mg²⁺-dependent endonuclease specific to double-stranded DNA in the preparations of B. m. NPV polymerase. The endonuclease exists in the B. m. NPV polymerase preparations after ammonium sulphate fractionation, phosphocellulose and hydroxyapatite chromatography but may be separated from B. m. NPV polymerase by glycerol gradient ultracentrifugation in the presence of 200 rnM potassium phosphate. At the lower salt concentrations B. m. NPV polymerase and the endonuclease reveal a tendency to aggregation.