Використання дріжджової двогібридної системи для пошуку S6K1 та S6K2 зв'язуючих партнерів

Abstract

Кіназа рибосомного білка S6 (S6K) задіяна в сигнальних механізмах регуляції проліферації, диференціації та клітинного росту. На сьогодні відомо дві форми S6K (S6K1 та 2), які мають цитоплазматичний та ядерний сплайсингові варіанти. Відомо лише декілька фізіологічних суб­стратів S6K і партнерів її білково-білкової взаємодії. Для пошуу нових партнерів взаємодії з S6K1 та 2 нами використано дріжджову двогібридну систему. За допомогою аналізу шести створених "bait"-конструктів виявлено, що тільки повнорозмірна форма S6K1 відповідала вимогам двогібридного скринінгу. Великомасштабний скринінг кДНКової бібліотеки ембріона миші дозволив нам виявити 26 позитивних клонів, 13 з яких підтверджено методом статевого злиття. Рестрикційні дослідження і аналіз послідовностей даних клонів показали, що всі вони містять кДНК розміром близько 4000 п. н. з однаковою картиною рестрикції та послідов­ностями на 5'- та 3'-кінцях. Порівняння отриманих послідовностей з геномными та білковими банками даних засвідчило, що кДНК одержаних клонів кодує фрагмент нового білка. Первинна структура даного білка та особливості його взаємодії з S6K знаходяться в процесі вивчення.

Киназа рибосомного белка S6 (S6K) причастна к сигнальным механизмам регуляции пролиферации, дифференциации и клеточного роста. На сегодня известны две ее формы (S6K1 и S6K2), имеющие цитоплазматический и ядерный варианты сплайсинга. Известно лишь нескольки физиологических суб­стратов S6K и партнеров ее белково-белкового взаимодейст­вия. Для поиска новых партнеров взаимодействия с S6K1 и 2 нами использована дрожжевая двугибридная система. С по­мощью анализа шести созданных "bait"-конструктов выявле­но, что только полноразмерная форма S6K1 отвечала требо­ваниям двугибридного скрининга. Крупномасштабный скри­нинг кДНКовой библиотеки эмбриона мыши позволил нам выявить 26 позитивных клонов, 13 из которых подтверджены методом полового слияния. Рестрикционные исследования и анализ последовательностей данных клонов показали, что все они содержат кДНК размером около 4000 п. н. с одинаковой картиной рестрикции и последовательностями на 5'- и 3'-концах. Сравнение полученных последовательностей с геномными и белковыми банками данных свидетельствует о том, что кДНК полученных клонов кодирует фрагмент нового белка. Первичная структура данного белка и особенности его взаи­модействия с S6K находятся в процессе изучения.

The kinase of the ribosomal protein S6 (S6K) is involved in the signalling pathways which regulate the cell proliferation, differentiation and growth. The family of S6K consists of two forms (S6K1 and 2), which have cytoplasmic and nuclear splicing variants. The activity of S6K is regulated by phosphorylation/dephosphorylation events and specific protein-protein interactions. We have employed yeast two-hybrid system in search of novel S6K binding partners. Among six created «bait» constructs, only the full length S6K1 meets the requiments of the yeast two-hybrid screening. The large-scale screening of mouse embryo cDNA library allowed us to identify 26 positive clones and 13 of them were confirmed in mating analysis. The restriction and sequence analysis of these clones showed that all of them contain cDNAs of approximetly 4000 bp with the same restriction pattern and sequence at 5' and 3' ends. Comparison of the sequences obtained with the genomic and protein databases has shown that identified cDNA codes a fragment of novel protein. The primary structure of this protein and specificity of its interaction with S6K. are currently under investigation.