Способы защиты ДНК цианофага LPP-3 oт систем рестрикции – модификации цианобактерии Plectonema boryanum

Abstract

Для проверки наличия модифицированных оснований в ДНК цианофага LPP-3 и цианобактерии P. boryanum использовали метод HPLC с помощью установки «System GOLD». Анализ профиля элюции гидролизатов позволил идентифицировать, кроме канонических оснований присутствие в ДНК P. boryanum 5-метилцитозина в концентрации 1,2 % и N-6-метиладенина — 4 5 %. ДНК LPP-3 содержит 0,8% 5-метилцитозина и не включает N-6-метиладенина. 5-Метилцитозин удалось обнаружить только модифицированным методом гидролиза, ДНК фтористоводородной кислотой. Для выявления сайтспецифического метилирования ДНК цианофага LPP-3 и ДНК P. boryanum подвергали ферментативному гидролизу рестриктазами-изошизомерами, по-разному реагирующими на метилирование остатков цитозина и аденина в сайтах узнавания. Установлено метилирование по аденину в GАТС-последовательностях ДНК P. boryanum и по второму иитозину CC(AIT )G G-последовательностей как в ДНК P. boryanum, так и в ДНК LPP-3. Делается вывод о наличии у P. boryanum систем рестрикции – модификации dam- и dcmІ -подобного типа. Защита вирусного генома от систем рестрикции-модификации хозяина осуществляется метилированием последовательности CmC(A/T)GG и контрселекцией по сайту BamHI. По данным, рестрикционного анализа, контр се лекции, очевидно, подвержена и последовательность GG(CIG)CC.

Для перевірки наявності модифікованих основ у ДНК ціанофага LPP-3 і ціанобактерії P. boryanum використано метод HPLC за допомогою установки "System GOLD". Аналіз профілю елюції гідролізатів дозволив ідентифікувати, окрім канонічних основ, присутність у ДНК P. boryanum 5-мєтилцитозипу в концентрації 1,2% та N-6-метиладеніну – 4,5 %. ДНК LPP-3 містить 0,8% 5-метилцитозину і не включає N-6-метиладеніну. 5-Метилцитозии вдалося виявити лише модифікованим методом гідролізу ДНК фтористоводневою кислотою. Для виявлення сайтспсцифічпого метилювання ДНК ціанофага LPP-3 і ДНК P. boryanum піддавали ферментативному гідролізу рестриктазами-ізошизомерами, по-різному реагуючими на метилювання залишків цитозину і аденіну в сайтах пізнавання. Встановленно метилювання по аденіну в GATC-послідовностях ДНК P. boryanum та по другому цитозину GC (А/Т) GG-послідовностей як у ДНК P. boryanum, так і в ДНК LPP-3. Зроблено висновок про наявність у P. boryanum систем рестрикції – модифікації dam- і dcml-подібного типу. Захист вірусного генома від систем рестрикції – модифікації хазяїна здійснюється метилюванпям послідовності CmC (А/Т) GG і контрселекцією за сайтом BamHI. Коптрселекції, скоріш за все, піддається і послідовність GG(C/G)CC, що підтверджується даними рестрикційного аналізу.

HPLC method was used to study some peculiarities of cyanobacterium Plecloneina boryanum and cyanophage LPP-3 DNA composition. The elution profile analysis of the products of DNA acid hydrolysis enable to identify in DNA P. boryanum apart of canonical bases the presence of 4.5 % N-6-melhyladenine and 1.2 % 5-methyl-cytosine, DNA LPP-3 have 0,8 % 5-methyIcytosine and no N-6-methyladenine. The presence of 5-methylcytosine was detected only due to the application of the modified hydrolysis method HF. The restriction endonucleases-isoshisomers, DNA hydrolysis of which depend on presence of methylated bases in the recognition sites, were used to detect site-specific methylation. The comparison of the products of the DNA LPP-3 and P. boryanum fermentative hydrolysis by Mspl and Hpall; Sau3A, Mbol and Dpnl; Apyl and Mval restrictases enable to determined that DNA LPP-3 and P. boryanum has a high methylation degree of the inner cytosine in the CC(A/T)GG site and P. boryanum on the adenine in the GATC site; CCGG site wasn't methylated in both DNA. Proceeding from the data obtained a conclusion can be drown on the presence of dam- and dcml-like restriction–modification systems in P. boryanum. Defence of viral DNA against host R-M systems occur by cytosine methylation in sequence CmC(A/T)GG and counter-selection BamHI sites.