Изучение влияния различных концентраций индуктора на выход альфа-2b интерферона человека в системе экспрессии на основе РНК-полимеразы фага Т7 в клетках Escherichia coli

Abstract

Биосинтез альфа-2b интерферона человека (ИФН) в іслетках Е. coli BL21 (DE3), несущих плазмиду рЕТ-аИФН, индуцировали различными (от 0,01 до 10 мМ) концентрациями изопропил-β-D-тиогалактозида (ИПТГ). Плазмида рЕТ-аИФН содержит искусственный ген ИФН под контролем промотора гена 10 фага Т7. Ген РНК-полимеразы фага Т7 находится в хромосоме клеток Е. coli BL21 (DE3) под контролем lac-UV5 промотора Е. coli. Обнаружено, что значение минимальной концентрации ИПТГ, обеспечивающей эффективную экспрессию целевого белка, возрастает с понижением температуры культивирования продуцента после индукции. Так, при 37 °С полная индукция достигается внесением в среду ИПТГ в конечной концентрации 0,06 мМ, а при 21 °С –0,1 мМ. Показано, что снижение концентрации индуктора до 0,01 мМ не способствует накоплению ИФН в растворимой форме при культивировании продуцента при температуре 37 °С. Также установлено, что ИПТГ в конечной концентрации до 2 мМ не оказывает негативного влияния на литическое развитие бактериофага лямбда и инфицированные им плазмидосодержащие клетки лизируются, в результате чего рекомбинантный белок в растворимой форме накапливается непосредственно в культуральной среде. Минимальная концен­трация ИПТГ, обеспечивающая максимальный выход ИФН при данном способе его получения, составляет 0,2 мМ.

Біосинтез альфа-2b інтерферону людини (ІФН) у клітинах Е. coli BL21 (DE3), які несуть плазміду рЕТ-αІФН, індукували різними (від 0,01 до 10 мМ) концентраціями ізопропіл-β-D-тіогалактозиду (ІПТГ). Плазміда рЕТ-αІФН містить штуч­ний ген ІФН під контролем промотора гена 10 фага Т7. Ген РНК-полімерази фага Т7 знаходиться в хромосомі клітин Е. coli BL21 (DE3) під контролем lac-UV5 промотора Е. coli Виявлено, що значення мінімальної концентрації ІПТГ, яка забезпечує ефективну експресію цільового білка, зростають із зниженням температури культивування продуцента після індукції. Так, при 37 °С повна індукція досягається внесенням до середовища ІПТГ у кінцевій концентрації 0,06 мМ, а при 21 °С–0,1 мМ. Показано, що зниження концентрації індуктора до 0,01 мМ не сприяє накопиченню ІФН у розчинній формі при культивуванні продуцента при температурі 37 °С. Також визначено, що ІПТГ у кінцевій концентрації до 2 мМ не чинить негативного впливу на літичний розвиток бактеріо­фага лямбда і інфіковані їм клітини, що містять плазміду, лізуються, в результаті чого рекомбінантний білок у роз­чинній формі накопичується безпосередньо в культуральному середовищі. Мінімальна концентрація ІПТГ, яка забезпечує максимальний вихід ІФН при цьому способі його отримання, складає 0,2 мМ.

Various concentrations (from 0.01 up to JO MM) of isopropyl-fi-D-thiogalactoside (IPTG) were used to induce the human atpha~2b interferon (IFN) biosynthesis by recombinant E. coli BL21 (DE3) cells, harboring plasmid pET-alFN. The plasmid pET-alFN carries an artificial gene for IFN, which is under the control of the gene 10 phage T7 promoter. The gene for phage T7 RNA polymerasc is situated in the chromosome of E. coli BL2I (DE3) cells under the control of the lac-UV5 E. coli promoter. We have found, that a minimum concentration of IPTG, ensuring effective expression of the target protein, increases with the lowering of the producer cultivation temperature after induction. Thus, the full induction is achieved by adding IPTG to the medium in final concentration 0.06 mM at 37 °C, and 0,1 mM at 21 °C. It was shown, that the decrease of inductor concentration up to 0.01 mM did not promote accumulation of IFN in a soluble form when producer was cultivated at the temperature of 37 °C. It was also determined that IPTG in final concentration up to 2 mM did not have negative effect on the lytic development of bacteriophage lambda. As a result of the lysis of E. coli BL (pET-alFN) cells, infected by phage, the recombinant protein in a soluble form accumulates immediately in a growth medium. The minimum concentration of IPTG, ensuring the maximum yield of IFN obtained by this method is 0.2 mM.