Identification of Ca²⁺/calmodulin-dependent phosphorylation sites of endocytic scaffold ITSN1 by tandem mass spectrometry

Abstract

ITSN1 is a scaffold protein involved in endocytosis, signal transduction and cytoskeleton regulation. It has been previously shown that ITSN1 undergoes Ca²⁺/calmodulin-dependent phosphorylation in vitro. Aim. We intend to identify these phosphorylation sites. Methods. In vitro kinase reaction; liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC/MS/MS). Results. We identified five sites of Ca²⁺/calmodulin-dependent phosphorylation in the recombinant fragments of ITSN1. Conclusions. We have shown that the ITSN1 coiled-coil region (CCR) and the interdomain linkers between EH2 and CCR, SH3A and SH3B, SH3B and SH3C domains were phosphorylated in a Ca²⁺/calmodulin-dependent manner in vitro.

ITSN1 – це скафолдний білок, задіяний у процесах ендоцитозу, сигнальної трансдукції та регуляції цитоскелету. Раніше було показано, що ITSN1 підлягає Ca²⁺/кальмодулін-залежному фосфорилюванню in vitro. Мета. Ідентифікувати сайти цього фосфорилювання. Методи. In vitro кіназна реакція; рідинна хроматографія, поєднана з тандемною мас-спектрометрією (LC/MS/MS). Результати. Ми ідентифікували 5 сайтів Ca²⁺/кальмодулін-залежного фосфорилювання у рекомбінантних фрагментах ITSN1. Висновки. Було показано, що надспіралізована ділянка (CCR) та міждоменні лінкери між ЕН2 та CCR, SH3A та SH3B, а також між SH3B та SH3C доменами ITSN1 підлягають Ca²⁺/кальмодулін-залежному фосфорилюванню.

ITSN1 является скаффолдным белком, задействованным в процессах эндоцитоза, сигнальной трансдукции и регуляции цитоскелета. Ранее было показано, что ITSN1 подлежит Ca²⁺/кальмодулин-зависимому фосфорилированию in vitro. Цель Идентифицировать сайты Ca²⁺/кальмодулин-зависимого фосфорилирования ITSN1. Методы. In vitro киназная реакция, жидкостная хроматография в сочетании с тандемной масс-спектрометрией (LC/MS/MS). Результаты. Мы идентифицировали 5 сайтов Ca²⁺/кальмодулин-зависимого фосфорилирования в рекомбинантных фрагментах ITSN1. Выводы. Было показано, что суперспирализированый участок (CCR) и междоменные линкеры между ЕН2 и CCR, SH3A и SH3B, а также между SH3B и SH3C доменами ITSN1 подвергаются Ca²⁺/кальмодулин-зависимому фосфорилированию.