Полимеразная цепная реакция (ПЦР) для диагностики вирусной инфекции: цитомегаловирус человека

Abstract

Описана процедура быстрого, чувствительного а точного определения цитомегаловируса (ЦМВ) в тканях и биологических жидкостях человека с помощью термофильной ДНК-по ли ме разы из Thermus thermophilus. Процедура состоит из двух последовательных ПЦР. Первая включает 40 циклов (денатурация ДНК, отжиг праймеров и ДНК-полимеризация), выполняемых с двумя праймерами по 20 оснований, консервативная последовательность которых взята из гена MIE (major immediate early) ЦВМ. Вторая реакция включает от 20 до 50 циклов, аналогичных первым, но на основе 20-членных праймеров, фланкирующих внутреннюю часть фрагмента ДНК, намноженного ранее. Конечный фрагмент обнаруживается по окрашиванию бромистым этидием после электрофореза в полиакриламидном геле. Верификация искомой полосы включает ее рестрикционный анализ. С помощью плазмиды рСМ5018, несущей ген MIE вируса, показано, что предлагаемая процедура может выявлять столь малые количества ДНК, как несколько (от 1 до 5) плазмидных молекул.

Описана процедура швидкого, чутливого та точного визначення цитомегаловірусу (ЦМВ) у тканинах і біологічних рідинах людини за допомогою термофільної ДНК-полімерази Thermus thermophilus. Процедура складається з двох послідовних ПЦР. У першій реакції проходить 40 циклів (денатурація ДНК, ренатурація праймерів і ДНК-полімерізація), що виконуються з двома праймерами по 20 основ, консервативна послідовність яких узята із гену MIE (major immediate early) ЦМВ. Друга реакція включає від 20 до 50 циклів, що відповідають першим, але на основі 20-членних праймерів, які ампліфікують внутрішню частину фрагменту ДНК (останній намножений раніше). Кінцевий фрагмент виявляється при фарбуванні бромистим етидієм після електрофорезу в поліакриламідному гелі. Веріфікація потрібної смуги провадиться і на·основі рестрикційного аналізу. За допомогою плазміди рСМ5018, що несе ген MIE вірусу, показано, що пропонована процедура може виявляти такі малі кількості ДНК, як декілька (від 1 до 5) плазмідних молекул.

A rapid, sensitive and precise procedure of detecting cytomegalovirus (CMV) DNA in human tissue and biological liquid by means of the thermostable DNA-polymerase from Thermus thermophilus is described. The procedure consists of two consecutive PCRs. The-first one includes 40 cycles of denaturation, primer annealing and chain extension with two 20-base primers chosen from the conserved sequence ot MIE (major immediate early) gene of CMV. The second reaction includes from 20 up to 50 cycles consisting of the same steps but with 20-base primers chosen to amplify the internal part of the fragment amplified during the first reaction. The final fragment is detected by the ethidium bromide staining after polyacrylamide gel electrophoresis. Verification of the band includes restriction enzyme analysis. Use of pCM5018 plasmid bearing the CMV MIE gene shows that the proposed procedure can detect as little as several (from 1 to 5) molecules of DNA.