Невирусная доставка гена ароА1 человека в клетки млекопитающих in vitro и in vivo

Abstract

Исследованы подходы к генной терапии атеросклероза путем невирусного переноса гена аполипопротеина A1 (ароА1) – основного белкового компонента антиатерогенных липопротеинов – в клетки печени. Сконструирован плазмидный вектор для экспрессии полноразмерного гена ароА1 человека в клетках млекопитающих. Конструкция содержит последовательности бактериальной плазмиды, позволяющие ей реплицироваться в клетках Escherihia coli, и кассету для экспрессии гена ароА1, фланкированную инвертированными терминальными повторами аденоассоциированного вируса человека. Для доставки векторной ДНК использован синтетический полимер полиэтиленимин (ПЭИ, 25 кДа). Показано>, что в результате ПЭИ-опосредованной трансфекции клеток в культуре аналогичным вектором, содержащим репортерный ген зеленого флуоресцирующего белка, 50–70 % клеток экспрессируют введенный ген. На экспериментальных животных, которым вводили конструкцию с геном ароА1 человека прямой инъекцией в печень, продемонст­рировано, что белок АроАІ человека тестируется в плазме крови в течение 15 сут после доставки гена. ПЦР-анализ суммарной ДНК печени подопытных животных показал наличие расчетного фрагмента гена apoA1 человека у крыс через 15 дней после введения гена

Some approaches to the gene therapy of atherosclerosis by non-viral transfer of human apoA1 gene, encoding the main protein component of antiatherogenic lipoproteins, into liver cells are being studied. The plasmid vector for the expression of the human genomic apoA1 gene in mammalian cells has been constructed. The construction contains bacterial plasmid sequences for its replication in Escherihia coli and expression cassette for human apoA1 gene flanked by inverted terminal repeats of human adeno-associated virus. The cationic polymer polyethylenimine of 25 kD (PEI) has been used for gene delivery. It has been shown, that 50–70 % of cells express transgene after PEI-mediated in vitro transfection with analogical vector containing reporter green fluorescence protein gene. The experiments on animals have demonstrated, that the human protein ApoA1 is being tested in animal plasma during 15 days after apoA1 gene injection in the liver. PCR-analysis of total liver DNA of experimental animal has shown the presence of expected fragment of apoA1 gene in rat liver in 15 days after the gene delivery.

Досліджували підходи до генної терапії атеросклерозу невірусного переносу гена аполіпопротеїну А1 (apoA1) — основного білкового компонента антиатерогенних ліпопротеїнів — у клітини печінки. Сконструйовано плазмідний вектор для екс­пресії повнорозмірного гена apoA1 людини в клітини ссавців. Конструкція містить послідовності бактеріальної плазміди, які дозволяють їй реплікуватися в клітинах Escherihia coli, і касету для експресії гена apoA1, фланковану інвертованими термінальними повторами аденоасоційованого вірусу людини. Для доставки векторної ДНК використано синтетичний полі­мер поліетиленімін 25 кДа (ПЕІ). Показано, що в результаті ПЕІ-опосередкованої трансфекції клітин у культурі анало­гічним вектором, який містить репортерний ген зеленого флуоресцентного білка, 50–70 % клітин експресують введе­ний ген. На експериментальних тваринах, яким вводили конструкцію с геном apoAl людини прямою ин'єкцією в печінку, продемонстровано, що білок ApoA1 людини тестується в плазмі крові протягом 15 діб після доставки гена. ПЛР-аналіз сумарної ДНК печінки піддослідних тварин показав наявність розрахованого фрагмента гена apoAl людини у щурів через 15 днів після введення гена.