272 ТАВРИЧЕСКИЙ МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКИЙ ВЕСТНИК2012, том 15, № 1 (57) УДК 616.24-002.5:616-018:616-076 © Т .Г. Филоненко, 2012. ОСОБЕННОСТИ ЛОКАЛИЗАЦИИ КОЛЛАГЕНА IV ПРИ ФИБРОЗНО-КАВЕРНОЗНОМ ТУБЕРКУЛЕЗЕ Т. Г. Филоненко Кафедра патологической анатомии с секционным курсом, ГУ «Крымский государственный медицинский университет имени С.И.Георгиевского», г.Симферополь, АР Крым, Украина. PECULIARITIES of COLLAGEN IV LOCALIZATION IN FIBROUS-CAVERNOUS TUBERCULOSIS T. G. Filonenko SUMMARY In scientific literature there is fragmentary information about a presence, localization and prevalence of undegraded collagen IV type and its role in the mechanism of pneumofibrosis and disturbances of the system of pulmonary host defense in fibrous-cavernous tuberculosis. Research purpose: to define the morphological features of connective tissue and estimate the value of expression of collagen IV type in fibrous-cavernous tuberculosis with use immunohistochemical investigation of pulmonary tissue of patients, operated due to fibrous-cavernous tuberculosis with active bacteria’s excretion (n=84) and patients without bacteria’s excretion (n=59). The analysis of morphological research determined that in fibrous-cavernous tuberculosis without bacteria’s excretion the intensive expression of collagen IV takes place. The decrease of expression is determined in active fibrous-cavernous tuberculosis. Regardless of bacteria’s excretion in the areas of emphysema the intensive expression of collagen IV type is determined as a dense double contour. ОСОБЛИВОСТІ ЛОКАЛІЗАЦІЇ КОЛАГЕНУ IV ПРИ ФІБРОЗНО-КАВЕРНОЗНОМУ ТУБЕРКУЛЬОЗІ Т. Г. Філоненко РЕЗЮМЕ У літературі є фрагментарні відомості про наявність, локалізацію і поширеність важкодеградуючого білка колагену IV типу та не визначено його ролі у механізмі пневмофіброзу і порушення системи місцевого захисту легень при фіброзно-кавернозному туберкульозі легень. Мета дослідження: визначити морфологічні особливості сполучної тканини й оцінити значення експресії колагену IV типу при фіброзно-кавернозному туберкульозі за допомогою імуногістохімічного дослідження ділянки тканини легень у хворих, оперованих з приводу фіброзно-кавернозного туберкульозу легень з активним бактеріовиділенням (n=84) і без бактеріовиділення (n=59). Аналіз морфологічного дослідження показав, що при фіброзно-кавернозному туберкульозі без бактеріовиділення має місце виражена експресія колагену IV типу. Відзначається зниження оптичної щільності при активному фіброзно-кавернозному туберкульозі. Незалежно від бактеріовиділення в ділянках компенсаторної емфіземи при фіброзно- кавернозному туберкульозі визначається виражена експресія колагену IV типу у вигляді щільного подвійного контуру. Ключевые слова: туберкулез, коллаген, иммуногистохимия. Одной из проблем прогрессирующего хроничес- кого течения туберкулезной инфекции является раз- витие фиброза в ткани легкого, проявляющегося не только образованием фиброзных каверн, но и выра- женными склеротическими процессами, ведущими к нарастанию тканевой гипоксии и нарушению сис- темы местной защиты легких [3]. У больных фиброз- но-кавернозным туберкулезом (ФКТ) эффективность полихимиотерапии ограничена, так как частота зак- рытия каверн у таких больных, по данным различных авторов, колеблется от 0,5 до 5,0%, а прекращение бактериовыделения происходит лишь у 40-50% боль- ных [3,4,5,13]. Многообразие функций соединительной ткани, таких как биомеханическая, репаративная, метабо- лическая, морфогенетическая, предопределяет ши- рокий спектр ее патологических состояний [4,11,19]. Известно, что составной частью внеклеточного матрикса соединительной ткани являються фибрил- лярные структуры, в которых основную роль играют белки коллагена I, II, IV, образуя каркас всех легоч- ных структур. Именно благодаря коллагену IV типа базальные мембраны характеризуются механичес- кой стабильностью и нерастворимостью[18,19]. При иммуногистохимическом исследовании уже на ран- них стадиях воспаления можно выявить в интерсти- ции легких накопление всех типов коллагена с преоб- ладанием коллагена III типа, который доминирует в эмбриональном легком, и является наиболее благо- приятным стромальным компонентом для роста и формирования легочной ткани [12,14,17]. Коллагены же IV и V типов относятся к группе труднодеградиру- емых белков и могут расщепляться только коллаге- назой IV типа, не обнаруживаемой в легочной ткани и в клетках воспалительного инфильтрата. Данный фермент продуцируется только клетками трансфор- мированного бронхиального эпителия [11]. В лите- ратуре имеются немногочисленные и фрагментар- 273 О Р И Г И Н А Л Ь Н Ы Е С Т А Т Ь И ные сведения о наличии, локализации и распростра- нённости труднодеградируемого белка коллагена IV типа и его роль в механизме снижения системы мес- тной защиты легких и прогрессировании туберкулез- ного процесса [12,14,16,17]. Кроме того, исследования Ерохина В.В., Рома- новой Л.К. и других исследователей предполагают неоднозначную роль межклеточных взаимодействий в формировании пневмосклероза и фиброзной ка- верны [1,5,6,8,9,10,16,17]. Таким образом, напряженная ситуация по тубер- кулезу, увеличение количества больных прогрессиру- ющим фиброзно-кавернозным туберкулезом легких с развитием выраженного фиброза и пневмосклеро- за, отсутствием патогенетической терапии с целью профилактики развития склеротических процессов оп- ределяют актуальность данной темы и дают широкие возможности для дальнейшего исследования. Цель работы: определить морфологические осо- бенности соединительной ткани и оценить значение экспрессии коллагена IV типа при фиброзно-кавер- нозном туберкулезе. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Материалом для гистологического, гистохимичес- кого и иммуногистохимического (ИГХ) исследования взяты участки ткани легких у 84 больных, оперирован- ных по поводу фиброзно-кавернозного туберкулеза легких с активным бактериовыделением (МБТ+) и 59 больных без бактериовыделения (МБТ– ). Возраст боль- ных варьировал от 40 лет до 65 лет и давностью заболе- вания от 7 до 15 лет. По локализации каверны находи- лись в обеих легких, в основном в верхних долях в 1 и 2 сегментах с преобладанием в правом легком. Участки легочной ткани размером 1х0,5х0,5см фиксировали 10% забуференым формалином, зали- вали в парафин и изготавливали срезы толщиной 5 мкм с последующей обзорной окраской гематокси- лином и эозином и с применением окраски по Ван Гизону (пикриновая кислота и кислый фуксин) по стандартной методике [2]. В результате гистохими- ческой реакции ядра клеток приобретают чёрный цвет, коллаген - красный, другие тканевые элементы (вклю- чая мышечные волокна и эритроциты) - желтые, фиб- рин - жёлтый или оранжевый. Позитивную реакцию соединительной ткани оценивали полуколичествен- ным методом, учитывая интенсивность окраски. ИГХ исследование проводили с использовани- ем парафиновых блоков и реактивов компании DAKO с моноклональными антителами Collagen IV (Clone CIV 22) - маркера соединительной ткани ба- зальных мембран, системы визуализации EnVision™ FLEX+, Mouse, High pH (Link), Code K8012 на авто- стейнере фирмы DAKO [15]. Результаты ИГХ исследования оценивали с уче- том распределения экспрессии Collagen IV в базаль- ных мембранах, интенсивности реакции и характера взаимодействия с другими структурными элемента- ми ткани легкого. Оценку иммуногистохимической реакции проводили в 10 полях зрениях при увеличе- нии 200. Интенсивность экспрессии оценивали по- луколичественным методом на основании выражен- ности и целостности окраски базальных мембран по следующей схеме: низкая, умеренная и высокая, учи- тывая локализацию патологических процессов. В ка- честве контроля использовали участки ткани легких, взятые у 10 больных, умерших от патологии, не свя- занной с заболеванием легких и инфекционными за- болеваниями. Фотографирование осуществляли цифровой ка- мерой OLYMPUS C 5050Z, установленной на микро- скопе OLYMPUS СХ 41. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ При морфологическом исследовании ткани лег- кого у всех исследуемых больных ФКТ наблюдаются ярко выраженные признаки склеротических процес- сов, проявляющихся в различной степени выражен- ности объемной массы и разнообразием локализа- ции соединительной ткани. Во всех случаях в наибольшей степени фиброз- ные изменения наблюдаются при ФКТ (МБТ– ) вбли- зи каверн на фоне ателектаза и дистелектаза легоч- ной ткани. Коллагеновые волокна плотные, хаотично переплетаются между собой и имеют интенсивный красный цвет при окраске по методу Ван Гизона. При этом от фиброзного слоя стенки каверны ради- арно отходят фиброзные тяжи, которые дальше к пе- риферии образуют сеть, повторяющую границы ле- гочных долек и распространяющуюся иногда по все- му сегменту и доле легкого (рис.1). Рис.1. ФКТ МБТ– . Стенка фиброзной каверны. Окраска по Ван Гизону, х400. ИГХ исследование с коллагеном IV типа в конт- рольных срезах легочной ткани показало, что выра- женная экспрессия белка определяется по ходу ба- зальных мембран, в том числе сосудистого русла, бронхиального дерева, в интерстиции альвеолярных перегородок в виде коричневых линейных полосок различной толщины в зависимости от функциональ- ного значения легочных структур. 274 ТАВРИЧЕСКИЙ МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКИЙ ВЕСТНИК2012, том 15, № 1 (57) При ФКТ (МБТ– ) в большей степени выражен- ности экспрессия коллагена IV отмечается в фиб- розной стенке каверны и в дис- и ателектатических участках перикавернозной области и имеет достаточ- но компактную позитивную реакцию, представлен- ную многочисленными переплетающимися между собой базальными мембранами (рис.2). Рис.2. ФКТ МБТ–. Высокая оптическая плотность базальных мембран в участке ателектаза. ИГХР с коллагеном IV, х200. В соседних с каверной бронхах различного калиб- ра, мерцательный эпителий которых сохранен, периб- ронхиально отмечается умеренной степени выражен- ности склеротические изменения. Коллагеновые во- локна при этом менее интенсивно окрашены пикро- фуксином в красный цвет. При ИГХ исследовании в стенке бронха и перибронхиальной области обнару- живается умеренная экспрессия коллагена IV. Вокруг бронхов с метаплазией мерцательного эпителия в многослойный плоский эпителий (МПЭ) позитивная реакция более интенсивная и соответствует выражен- ной степени экспрессии коллагена IV (рис.3). Рис.3. ФКТ МБТ– . Метаплазия в МПЭ. Выраженная экспрессия коллагена IV. ИГХР с коллагеном IV, х200. В очагах туберкулезного архива неактивные руб- цующиеся гранулемы также имели умеренную по- зитивную реакцию как при окраске пикрофуксином, так и при ИГХ исследовании, причем нитевидная экспрессия коллагена IV представляла собой «клу- бок» переплетающихся базальных мембран, окру- женный единой общей мембраной (рис.4). Рис.4. ФКТ МБТ–. Высокая оптическая плотность коллагена IV в неактивной рубцующейся гранулеме. ИГХР с коллагеном IV, х400. Кроме того, в некоторых случаях очаговая пози- тивная реакция проявляется в зоне гранулематозно- го воспаления с наличием большого количества эпи- телиоидных макрофагов и многоядерных клеток Лан- гханса. В участках гиперплазии бронхоассоциированной лимфоидной ткани вокруг лимфоидных фоллику- лов при ФКТ (МБТ– ) позитивная реакция коллаге- на IV как бы отграничивает лимфоидный фолли- кул, окружая его тонкой коричневой мембраной с визуализацией единичных мелких капилляров рас- положенных в герменативных центрах (рис.5). Рис.5. ФКТ МБТ–. Очаговая позитивна реакция вокруг лимфоидного фолликула. ИГХР с коллагеном IV, х 400. При исследовании ткани легких у больных актив- ным прогрессирующим ФКТ (МБТ+) в проксималь- 275 О Р И Г И Н А Л Ь Н Ы Е С Т А Т Ь И ных, по отношению к каверне отделах легкого, скле- ротические процессы, в основном, локализуются в межуточной ткани, сопровождающей дренирующие бронхи, а в дистальных - захватывают и другие соеди- нительнотканные прослойки легкого. В стенке про- грессирующей фиброзной каверны, гистологичес- ки представленной грануляционной тканью и нали- чием пролиферативного гранулематозного специфи- ческого воспаления, выраженная интенсивность ок- раски пикрофуксином сохраняется, но имеет разря- женную структуру. Экспрессия коллагена IV пере- распределяется следующим образом. Наиболее плот- ная позитивная реакция наблюдается в наружной фиброзной капсуле. В перикавернозной зоне, в уча- стках дис- и ателектаза оптическая плотность колла- гена IV снижается за счет инфильтрации клетками воспалительного ряда. В участках гиперплазии брон- хо-ассоциированной лимфоидной ткани вокруг лим- фоидных фолликулов экспрессия коллагена IV либо отсутствует, либо обнаруживается в единичных мел- ких капиллярах расположенных в герменативных цен- трах. Иногда рядом с фолликулами наблюдаются рас- ширенные лимфатические сосуды со слабой эксп- рессией белка в базальной мембране. В средней пор- ции стенки каверны, образованной специфической грануляционной тканью, слабая позитивная реакция отмечается вокруг активных туберкулезных грану- лем с наличием казеозного некроза в центре и пред- ставляет собой тоненькую прерывистую ниточку коричневого цвета. По периферии гранулем четко визуализируются базальные мембраны единичных мельчайших капилляров. В перибронхиальной области дренирующего брон- ха при активном прогрессирующем ФКТ (МБТ+) в при- сутствии большого количества макрофагов также на- блюдается сниженная оптическая плотность коллагена IV за счет выраженного воспалительного компонента. В очаге деструкции легочной ткани и обильного обсе- менения МБТ экспрессия белка вообще отсутствует. Независимо от активности бактериовыделения при ФКТ в участках компенсаторной эмфиземы экс- прессия коллагена IV четко визуализируется в ис- тонченных альвеолярных перегородках и имеет двой- ной контур базальных мембран (рис.6). Встречаются участки альвеолярной стенки с оди- ночным контуром базальной мембраны, как правило, заканчивающиеся разрывом стенки альвеолы. Следу- ет отметить, что в истонченном интерстиции альвео- лярной стенки практически отсутствуют клеточные эле- менты, определяются остатки базальных мембран с редукцией капилляров, а в нишах на альвеолярной по- верхности - единичные альвеолоциты и макрофаги. Анализ гистохимического и иммуногистохими- ческого исследований ткани легких при вторичном ФКТ позволил определить, что наиболее выражен- ная позитивная реакция с пикрофуксином и выра- женная экспрессия коллагена IV отмечается при ФКТ (МБТ–). В условиях нарастания активности специ- фического туберкулезного воспаления и бактерио- выделения, проявляющегося альтеративно-экссуда- тивными процессами, оптическая плотность экспрес- сии коллагена IV типа снижается. По-видимому, это связано с действием протеолитических ферментов нейтрофилов, распадающихся инфицированных ми- кобактерией макрофагов, структурно-метаболичес- кой перестройкой бронхиального эпителия, выделяю- щих коллагеназу, которая и рассасывает фибрилляр- ный белок коллаген IV типа. Затем, в процессе стиха- ния активности воспаления и развития пролифератив- ного воспаления с преобладанием в воспалительном инфильтрате лимфоцитов, плазмоцитов, фиброблас- тов, эпителиоидных макрофагов и гигантских клеток Лангханса усиливается тканевая гипоксия. Следова- тельно, усиливается пролиферация фибробластов, продукция коллагена с последующим формировани- ем грубой фиброзной ткани вокруг каверны, интер- стициального фиброза, утолщения и сближения ба- зальных мембран в виде «двойного контура» в истон- ченных альвеолярных стенках, которые имеют в сво- ем составе выраженную позитивную реакцию с мо- ноклональным антителом к коллагену IV типа. Таким образом, на фоне уменьшения активности воспаления фибробласты остаются активированны- ми и экстрацеллюлярно-матриксный компонент от- кладывается постоянно в увеличивающемся количе- стве, что ведет к развитию пневмофиброза, нараста- нию недеградируемого коллагена IV типа, нарушению органной архитектуры и функции легких, снижению системы местной защиты легких, что дает основание для поиска патогенетической терапии с целью профи- лактики развития склеротических процессов. ВЫВОДЫ 1. Сочетание воспаления, регенерации и фибро- за при ФКТ реализуется благодаря макрофагалъно- фибробластическому взаимодействию, играющему ключевую роль в регуляции роста и инволюции со- Рис.6. ФКТ МБТ–. Экспрессия коллагена IV в виде двойного контура в очаге эмфиземы. ИГХР с коллагеном IV, х400. 276 ТАВРИЧЕСКИЙ МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКИЙ ВЕСТНИК2012, том 15, № 1 (57) единительной ткани, основанному на обратной свя- зи между распадом и продукцией коллагена, нару- шение которой ведет к снижению местных защитных механизмов. 2. При фиброзно-кавернозном туберкулезе без бактериовыделения в ткани легких определяется вы- раженная экспрессия коллагена IV преимуществен- но в базальных мембранах капилляров фиброзной каверны, в перикавернозных очагах ателектаза, в не- активной гранулеме и вокруг лимфоидных фоллику- лов бронхо-ассоциированной лимфоидной ткани. 3. При фиброзно-кавернозном туберкулезе с ак- тивным бактериовыделением оптическая плотность коллагена IV типа снижается, в большей степени в участке дренирующего каверну бронха. 4. Независимо от бактериовыделения в участках компенсаторной эмфиземы в истонченных альвео- лярных перегородках определяется выраженная экс- прессия коллагена IV типа в виде плотного двойного контура. Перспективы дальнейших исследований пре- дусматривают разработку адекватного патогенети- ческого лечения вторичного ФКТ с учетом значимо- сти разрастания грубой фиброзной ткани с увеличе- нием в ее структуре труднодеградируемого коллаге- на IV в период хронизации пролиферативного вос- паления направленную на профилактику развития пневмофиброза и повышения системы местной за- щиты легких. ЛИТЕРАТУРА 1. Ариэль Б.М. Морфологические особенности фиброзно-кавернозного туберкулеза легких на опе- рационном материале / Б. М. Ариэль // Архив пато- логии. – 2004. – № 1. – С. 14-18. 2. Горальский Л.П. Основи гістологічної техніки і морфофункціональні методи дослідження у нормі та при патології / Л.П. Горальский, В.Т. Хомич, О.І. Кононський // Житомир: «Полісся», 2005. – 288с. 3. Гордиенко С. М. Туберкулез. Оценка ситуации / С. М. Гордиенко // Здоров’я України. – 2004. – № 22. – С. 16-17. 4. Ерохин В.В. Состояние соединительной ткани в процессе фибриллообразования при фиброзно-кавер- нозном туберкулезе легких/ В.В. Ерохин, A.A. Лесная // Архив патологии. – 1985. – №4. – С.36-42. 5. Ерохин В.В. Современные представления о ту- беркулезном воспалении / В. В. Ерохин, З. С. Земско- ва // Проблемы туберкулеза. – 2003. – № 3. – С. 11-21. 6. Ерохин В.В. Клеточная биология легких в нор- ме и при патологии / Под ред. В.В. Ерохина, Л.К. Ро- мановой. – М.: Медицина, 2000. – 234с. 7. Ерохин В.В. Молекулярные, субклеточные и клеточные механизмы патогенеза туберкулезного вос- паления легких/ В.В. Ерохин// Саратовский научно- медицинский журнал. – 2009. – Т.5, № 2. – С. 267-269. 8. Ефективність патоморфологічної діагностики ту- беркульозу / Є.І. Суслов, Т.П. Підгаєвська., С.Д. Кузовко- ва [та ін.] // Укр. пульмонол. журн. – 2007. – № 3. – С. 52-55. 9. Морфологія стінки хронічної ригідної триша- рової каверни у випадках фіброзно-кавернозного туберкульозу легень з різним ступенем активності його перебігу/ І. В. Ліскіна, С.Д. Кузовкова, Л.М. За- габа, С.О. Кравченко [та ін.] / Український пульмоно- логічний журнал. – 2010. – №1. – С. 49-53. 10.Пальцев М.А. Межклеточные взаимодействия / М.А. Пальцев, А.А. Иванов // М.: Медицина, 1995. – 224 с. 11.Серов В.В. Соединительная ткань (функцио- нальная морфология и общая патология) / В.В. Се- ров, А.Б. Шехтер //. М: Медицина, 1981. – 312с. 12.Суханова Л.А. Морфологические особеннос- ти туберкулеза легких в зависимости от состояния со- единительной ткани / Л.А.Суханова // Український пульмонологічний журнал. – 2009. – № 3. – С.29-32 13.Фещенко, Ю. І. Стан надання фтизіатричної допомоги населенню України / Ю. І. Фещенко // Укр. пульмонол. журн. – 2008. – № 3. – С. 7-9. 14.Bitterman P. Mechanisms of pulmonary fibrosis. Spontaneus release of the alveolar macrophage-derived growth factor in the interstitial lung disorders / P. Bitterman, S. Adelberg, R. Crystal // J. clin. Invest. – 1983. – Vol.72. – P. 1801-1814. 15.Dabbs D. Diagnostic immunohistochemistry / D. Dabbs. – 3rd ed. – Philadelphia, 2010. – 952 p. 16.Maternal Nicotine Induces Collagen Type IV Changes in the Mice Lung Parenchyma and its Vessels / Sh. Mohammadi, R.N. Mohammad, J. Mehdi [et al.] // Tanaffos. – 2011. – Vol. 10, № 2. – P. 32-37. 17.Mycobacterium tuberculosis Growth at the Cavity Surface: a Microenvironment with Failed Immunity/ Gilla Kaplan, Frank A. Post, Andre L. Moreira [et al.] // Infection and immunity. –2 003. – Vol. 71, № 12. – P. 7099-7108. 18. Nikravesh M.R. Pattern of collagen IV expression in glumerular and mesangial basement membrane during fetal and postnatal period of BALB/c mice / M.R. Nikravesh, M. Jalali, M.H. Karimfar [et al.] // Journal of Cell and Molecular Research. – 2009. – Vol. 1, № 2. – P. 90-95. 19.Ottani V. Collagen structure and functional implications / V.Ottani, M. Raspanti, A.Ruggeri // Micron. – 2001. – № 32 – P. 251 - 260.